La importancia de la fijación de tejidos y el procesamiento histológico en laboratorios de patología

La comprensión de muchas enfermedades y procesos fisiológicos solo fue posible después del descubrimiento del microscopio. Esta increíble herramienta permitió a los humanos observar un mundo mil veces más pequeño de lo que estaban acostumbrados a ver, revelando que muchos procesos previamente inexplicables se originaban en estructuras microscópicas.

Con el tiempo, la curiosidad humana llevó a la observación de varias estructuras, lo que llevó al desarrollo de herramientas y procedimientos para transformar estructuras gruesas y sin contraste en estructuras delgadas y contrastadas. Esto marcó el nacimiento de técnicas histológicas, que permiten la preparación de muestras, tejidos o células para su análisis a través de la microscopía óptica.

Después de la muerte o la extracción de tejidos, las muestras biológicas se deterioran naturalmente debido a enzimas autolíticas y microorganismos. La fijación de tejidos tiene como objetivo prevenir la autólisis y la proliferación bacteriana, preservar el metabolismo celular y el contenido bioquímico, mantener las relaciones tisulares para futuras tinciones y mejorar la diferenciación celular óptica mientras se preserva la identidad.

Los métodos de fijación de tejidos se pueden clasificar en fijación física y química. La fijación física implica calor o frío para preservar las muestras, mientras que la fijación química estabiliza las biomoléculas utilizando agentes como oxidantes, desnaturalizantes, aldehídos y sus combinaciones. Los aldehídos son ampliamente utilizados en histotecnología por su simplicidad, rentabilidad, resultados uniformes y calidad satisfactoria.

La entrecruzamiento intra e intermolecular altera significativamente las características físicas de los tejidos, especialmente la estructura de ciertas proteínas. Estos enlaces, que no se ven afectados durante el procesamiento histológico, deben ser eliminados antes de realizar técnicas inmunohistoquímicas para prevenir cambios en la antigenicidad de las proteínas y el reconocimiento de anticuerpos.

El formaldehído es el fijador de aldehído más ampliamente utilizado, típicamente comercializado en soluciones al 37 o 40%. A menudo se diluye a una solución comercial de formalina al 10%, lo que resulta en una concentración de formaldehído al 4%. Diluir la formalina directamente con agua en rutinas de laboratorio puede llevar a artefactos en los tejidos como la deposición de pigmento de formol.

Varios factores influyen en la fijación del tejido más allá de la solución fijadora y el método utilizado. Estos factores incluyen la temperatura, el volumen de la solución fijadora (se recomienda que sea 20 veces mayor que el tamaño del tejido), el pH de la mezcla fijadora, la osmolaridad y el grosor de la muestra que afecta la penetración de la fijación.

El tiempo de fijación varía dependiendo del tipo de fijador empleado. Respetar adecuadamente el período de fijación requerido preserva la morfología del tejido, la reactividad enzimática y la inmunorreactividad. La exposición prolongada a ciertos fijadores puede provocar el endurecimiento y la contracción del tejido, causando daños irreversibles.

El proceso de recolección implica extraer muestras biológicas de organismos vivos o fallecidos a través de biopsias, especímenes quirúrgicos o autopsias. Antes de la recolección, la preparación implica organizar el espacio de trabajo, configurar las herramientas de procesamiento y preparar la solución fijadora. El manejo cuidadoso de los tejidos, especialmente en necropsias, es crucial para prevenir la autólisis y mantener la integridad del tejido.

Después de que se completa el proceso de recolección, el tejido se sumerge en una solución fijadora para prevenir la autólisis. Este paso debe realizarse en un recipiente bien sellado para evitar la evaporación de los vapores y la contaminación ambiental. Es crucial realizar este procedimiento en gabinetes de bioseguridad con sistemas de extracción de vapores. La fijación inmediata después de la recolección es esencial para detener eficazmente la autólisis.

El tallado de secciones de tejido, conocido como 'tallado,' implica reducir el tamaño y el grosor de fragmentos de tejido fijado para mejorar la penetración del fijador y la difusión de reactivos durante el procesamiento histológico. El grosor recomendado para el tallado es de 3 milímetros, respetando el plano de corte ideal de cada órgano. El tallado adecuado con instrumentos afilados es crucial para garantizar una visualización clara del área de interés y prevenir artefactos inducidos por autólisis que puedan afectar el diagnóstico histopatológico.

La descalcificación es necesaria para el examen del tejido óseo debido a su matriz mineral y orgánica, que dificulta el corte y la visualización microscópica. Diversos métodos de descalcificación incluyen soluciones a base de ácido, histoquímicos, soluciones comerciales descalcificantes, resinas de intercambio iónico y descalcificadores electrolíticos. Factores como la urgencia del material, el grado de mineralización del tejido, los requisitos de tinción y el tipo de fijador influyen en la elección del método de descalcificación. Los descalcificadores a base de ácido, clasificados como ácidos débiles o fuertes, son comúnmente utilizados en laboratorios de patología. Los ácidos débiles como el acético, fórmico y pícrico son más lentos y suaves, adecuados para tejidos óseos menos densos. Los ácidos fuertes como el nítrico, clorhídrico y sulfúrico actúan rápidamente pero pueden causar daño tisular irreversible, recomendados para muestras altamente mineralizadas como el fémur y la tibia. Los métodos histoquímicos, como el EDTA, son suaves con los tejidos y quelan el calcio en los cristales minerales del tejido, convirtiéndolos en la opción preferida siempre que sea posible.

La descalcificación es un proceso crucial en histología que implica lavar los tejidos mineralizados con agua corriente antes de envolverlos en gasa, atarlos con una cuerda e sumergirlos en un recipiente de boca ancha con una solución descalcificante. La solución descalcificante debe ser 20 veces el tamaño del tejido, y el tejido debe suspenderse en la solución sin tocar el fondo para evitar depósitos de calcio. La agitación con un agitador magnético acelera el proceso al mejorar la interacción entre las moléculas descalcificantes y el calcio. Es esencial verificar continuamente el grado de mineralización y renovar la solución descalcificante diariamente para mantener su efectividad.

Después de la descalcificación, los tejidos deben ser lavados con agua corriente. Los tejidos descalcificados con ácido deben ser neutralizados con una solución alcalina para evitar daños a las tinciones nucleares. El material descalcificado, junto con el material no mineralizado, está listo para ser seccionado y procesado posteriormente.

El procesamiento implica reemplazar el agua en los tejidos con un medio más sólido para proporcionar la fuerza necesaria para el corte. Sustancias como OCT, resinas hidrofílicas e hidrofóbicas, y parafina son comúnmente utilizadas. El procesamiento con parafina requiere pasos de deshidratación, aclaramiento e impregnación para garantizar una infiltración adecuada del tejido. La difusión de sustancias apropiadas dentro y fuera del tejido es crucial para lograr una concentración uniforme.

La deshidratación es esencial para eliminar el agua de los tejidos antes de incluirlos en parafina. El etanol es un agente deshidratante común utilizado para eliminar el agua de los tejidos y fijadores. La clarificación, un paso intermedio entre la deshidratación y la impregnación, implica eliminar los residuos de alcohol utilizando un agente clarificante como el xileno. Una deshidratación adecuada es crucial para lograr una penetración exitosa de la parafina en los tejidos.

La impregnación implica saturar las cavidades y células del tejido con una sustancia, típicamente el medio de inclusión como la parafina. La parafina, debido a su efectividad y rentabilidad, se utiliza comúnmente en esta etapa. Debe estar completamente derretida para garantizar una penetración completa en los tejidos.

La eficiencia del procesamiento de tejidos se garantiza con un rango de temperatura entre 56 y 60 grados Celsius. Varios factores influyen en el procesamiento de tejidos, como el tamaño de la muestra, el tipo de reactivos utilizados, la especie animal, las propiedades del tejido, la presencia de vacío y la temperatura de procesamiento.

Los procesadores de tejidos automáticos son esenciales en histotecnología, permitiendo un procesamiento y diagnóstico de muestras más rápido. Vienen en dos tipos: carrusel y transferencia de fluidos. Las ventajas incluyen agitación constante, sistema de vacío, prevención de errores, temperatura controlada de parafina, ejecución de múltiples protocolos y operación continua.

Mientras que la mayoría de los laboratorios tienen procesadores automáticos, los consejos de procesamiento manual son valiosos para aquellos que no cuentan con este recurso. Se recomienda monitorear regularmente las concentraciones de reactivos para mantener la calidad del procesamiento. Independientemente de si el procesamiento es manual o automático, los tejidos deben ser lavados para eliminar el exceso de fijador, con procedimientos de lavado específicos dependiendo del fijador utilizado.

Un desafío del procesamiento manual es la necesidad de interrumpir y reanudar el procesamiento, lo que potencialmente afecta la calidad del tejido. Si el procesamiento se interrumpe, los tejidos deben dejarse en alcohol en lugar de xileno o parafina. Los tiempos de exposición adecuados en cada baño de procesamiento son cruciales para evitar problemas durante la microtomía.

Después del procesamiento, los tejidos deben ser incluidos en parafina en moldes para microtomía posterior. Cada laboratorio debe optimizar sus protocolos de procesamiento en función de factores como secuencias y tiempos de reactivos, asegurando un procesamiento eficiente y de alta calidad de los tejidos.

La inclusión es el proceso en el que el tejido se coloca en un molde cubierto con parafina derretida después de haber sido completamente impregnado en ella. Esto se puede hacer directamente desde la estufa o con la ayuda de una estación de inclusión, que garantiza una distribución adecuada de la temperatura. Las estaciones de inclusión constan de contenedores para casetes de tejido, contenedores de moldes, dispensadores de parafina, placas calefactoras y una placa de enfriamiento. Los sensores en las áreas de calentamiento controlan eficientemente la temperatura. Durante el proceso de inclusión, los tejidos se colocan en moldes llenos de parafina, asegurando que estén uniformemente soportados para un corte óptimo.

Durante la inclusión del tejido, es crucial mantener la temperatura de la parafina dentro de 5 grados Celsius por encima de su punto de fusión para evitar daños en el tejido. Se deben usar pinzas calientes, ya que las frías pueden dañar el tejido. Solo se deben incluir tejidos bien procesados, ya que los mal procesados pueden dificultar técnicamente las secciones histológicas. Los tejidos deben ser uniformemente soportados en el molde para garantizar un corte adecuado y una orientación óptima para el análisis.

Después de la inclusión del tejido, los bloques están listos para ser seccionados en láminas delgadas para su visualización bajo un microscopio óptico, un proceso conocido como microtomía. La microtomía requiere un profesional bien entrenado, equipo específico y manejo cuidadoso para garantizar cortes de alta calidad. Aspectos clave incluyen el tipo de microtomo utilizado, selección de cuchillas, procedimientos de lavado y etiquetado, sustancias adhesivas, ejecución de la microtomía y problemas técnicos comunes encontrados.

Los microtomos son equipos especializados utilizados para la sección de tejidos. Dependiendo del medio de inclusión, se utilizan microtomos específicos como criostatos para material congelado y ultramicrotomos para microscopía electrónica. En los laboratorios de histotecnología de rutina, se utilizan comúnmente microtomos rotativos y criostatos. Los microtomos rotativos pueden ajustar cortes de 1 a 60 micrómetros, con características como una manivela para el avance del bloque y capacidades de monitoreo.

Las cuchillas de microtomo utilizadas para cortar deben ser extremadamente afiladas. Hay dos tipos disponibles en el mercado: cuchillas de acero permanentes y cuchillas desechables. Las cuchillas permanentes requieren afilado y pulido manual después de su uso, lo cual es tiempo consumido y puede resultar en un trabajo de menor calidad en comparación con las cuchillas desechables. Las cuchillas desechables, hechas de acero inoxidable, vienen en versiones de alta y baja gama, algunas recubiertas en Teflón para una mayor durabilidad. Una vez que una cuchilla desechable pierde su filo, debe ser desechada en un contenedor adecuado para prevenir accidentes.

Antes de la microtomía, las diapositivas deben identificarse correctamente según los bloques a cortar. Hay sistemas disponibles para imprimir etiquetas que garanticen la fiabilidad y trazabilidad de la muestra. Si dicho sistema no está disponible, los técnicos pueden usar un lápiz con punta de diamante para escribir los números de caso en las diapositivas.

Los técnicos deben usar gafas protectoras y máscaras para prevenir la inhalación de polvo de vidrio y protegerse contra accidentes por fragmentos de vidrio. Se recomienda no usar lápices de grafito para etiquetar las diapositivas, ya que pueden dejar residuos negros no deseados.

Después de cortar, los tejidos deben adherirse a las diapositivas. Se recomienda utilizar la acción capilar con agua para la adhesión. Se pueden utilizar varios adhesivos tisulares como albúmina, gelatina, caseína y silano. La albúmina y la gelatina adhieren los tejidos a las diapositivas cuando se calientan en un horno. Se recomienda la albúmina de Maier para uso rutinario debido a su efectividad y bajo costo.

Una vez que las diapositivas están limpias y tratadas con adhesivo, el proceso de microtomía puede comenzar. El bloque de tejido se alinea paralelo a la cuchilla, se elimina la parafina en exceso y se enfría el bloque para facilitar el corte. Luego, las secciones se llevan a un baño frío o a una solución de alcohol al 30% para estirarlas.

Después de cortar, las secciones de tejido se transfieren a un baño de agua precalentada a 40-45°C o se colocan en una placa calefactora a 55°C. Las secciones están listas para ser colocadas en un soporte adecuado en el horno, que debe regularse entre 40 y 45°C. Las secciones deben permanecer en el horno durante un mínimo de 2 horas o durante la noche para evitar que se desprendan durante el teñido.

Muchos problemas técnicos en las técnicas histológicas son atribuidos erróneamente únicamente a la microtomía, pero la mayoría de los problemas realmente provienen de etapas anteriores como una fijación deficiente de la muestra, defectos en la descalcificación, errores en el procesamiento o la naturaleza del tejido. Los problemas específicos relacionados con la microtomía incluyen cuchillas mal afiladas que causan surcos en las secciones, angulación incorrecta de la cuchilla que lleva a cortes irregulares o rotura del bloque, y bloques defectuosos que resultan en cortes incompletos o pliegues.

Después de cada corte de bloque, es crucial que el técnico limpie el baño de agua para eliminar cualquier residuo de tejido antes de cortar un nuevo bloque. Esto minimiza la contaminación cruzada entre las muestras. Después de la microtomía, los bloques de tejido deben ser cubiertos con parafina derretida para prevenir la desecación y luego archivados para futuras referencias. Al final del día, el técnico debe limpiar el baño de agua con lejía para prevenir el crecimiento microbiano que podría afectar los resultados del examen.

Los bloques seleccionados para inmunohistoquímica deben ser cortados un día antes de la técnica para prevenir la pérdida de antígenos que puede ocurrir si las secciones se dejan en portaobjetos por mucho tiempo. Esto garantiza resultados de tinción óptimos y preservación de antígenos para un análisis preciso.

La criomicrotomía implica cortar tejidos fijados congelados y se utiliza comúnmente para diagnósticos preoperatorios inmediatos en salas de operaciones y centros de investigación. Para garantizar una criomicrotomía exitosa, las muestras deben ser seccionadas en piezas que no excedan los 3 milímetros para permitir una congelación uniforme. Luego se sumergen en una solución crioprotectora para mantener la estructura del tejido durante la congelación. Las temperaturas de congelación adecuadas por debajo de -170 grados Celsius son esenciales para prevenir la formación de cristales de hielo que pueden dañar las membranas celulares y las estructuras.

Para facilitar el intercambio de temperatura con la muestra, se utilizan soluciones como isopentano o acetona enfriadas en nitrógeno líquido. Las muestras sumergidas en OCT se envuelven en papel de aluminio y se sumergen en isopentano preenfriado en nitrógeno líquido. La muestra y el contenedor de isopentano luego se sumergen en nitrógeno líquido para congelación rápida. Después de congelar, la muestra se puede cortar o almacenar en nitrógeno líquido.

Los criostatos tienen el mismo sistema de angulación de la cuchilla que los microtomos convencionales y se pueden monitorear para el progreso del corte. El enfriamiento interno de la cámara puede llegar a -35 grados, con la cabeza alcanzando -55 grados. Los ajustes de temperatura entre -30 y -10 grados se realizan en función del tejido que se está cortando. La adhesión del bloque congelado a la placa de soporte del criostato recubierta con OCT es esencial para el corte.

El bloque congelado se recorta para un corte uniforme, y las secciones se estiran con un pincel para condiciones óptimas. Luego, las secciones se adhieren a portaobjetos de vidrio a temperatura ambiente, se tiñen y se almacenan para análisis futuro. Se deben seguir medidas adecuadas de bioseguridad durante el manejo de muestras, tinción y observación microscópica.

Después de la criomicrotomía, el micrótomo y las cuchillas en contacto con la muestra deben ser desinfectados. Las cuchillas usadas deben ser desechadas en un contenedor de objetos punzocortantes y autoclavadas. El manejo del nitrógeno líquido requiere precaución y equipo de protección como gafas. Los técnicos deben usar guantes apropiados, protección ocular y zapatos cerrados durante el proceso.

Después de que las secciones se montan en portaobjetos, se someten a tinción para hacer visibles los tejidos bajo el microscopio utilizando soluciones coloreadas. La tinción ayuda en la visualización y caracterización de los componentes celulares y tisulares para el análisis morfológico e histoquímico.

Los colorantes aportan color a los tejidos a través de mecanismos físicos y químicos. Los mecanismos físicos implican la difusión del tinte en los tejidos, como con tintes lipofílicos como el Sudan Black y el Sudan III. Los mecanismos químicos interactúan con los enlaces de biomoléculas como enlaces covalentes, iónicos y de hidrógeno. Los colorantes constan de un cromóforo responsable del color y un auxocromo que se une al sustrato.

Los colorantes con auxocromos básicos teñirán estructuras ácidas en los tejidos, mientras que los colorantes con auxocromos ácidos teñirán estructuras básicas.

La tinción de hematoxilina eosina se utiliza ampliamente en laboratorios de patología en todo el mundo, permitiendo la visualización de estructuras de tejido con núcleos teñidos de azul y citoplasma de color rosa.

Hematoxilina contiene un auxocromo básico que se une a sustratos de tejido ácidos como ácidos nucleicos, mientras que la eosina contiene un auxocromo ácido que se une a sustratos de tejido básicos como proteínas.

Hematoxilina, después de oxidarse a hemateína, es un tinte fuerte con alta afinidad por componentes ácidos como material nuclear y mucopolisacáridos.

Diferentes tipos de hematoxilina incluyen Ehrlich y Delafield (oxidados naturalmente), Maier (oxidado químicamente) y Harris (oxidado con óxido de mercurio). Las hematoxilinas de Maier y Harris son las más comúnmente utilizadas.

Harris hematoxilina es regresiva, requiere diferenciación con alcohol ácido y puede ser dañina debido al contenido de mercurio. La hematoxilina de Maier es progresiva, no necesita diferenciación, proporciona resultados uniformes y es menos tóxica.

El cambio de color de rojo a azul o morado en la tinción con hematoxilina es crucial, indicando una tinción adecuada.

Eosina se utiliza como contracolorante para la hematoxilina debido a su color rojo, uniéndose a grupos catiónicos en proteínas, glucógeno y otras moléculas.

La tinción se puede realizar sumergiendo individualmente las láminas en recipientes de tinción o utilizando recipientes de vidrio donde se dispensan las soluciones. La desparafinización y la hidratación son pasos cruciales para garantizar una correcta penetración del colorante y la calidad del tejido.

El proceso de tinción debe comenzar con dos baños en alcohol absoluto, seguido de baños en concentraciones decrecientes de alcohol (95% y 70%) hasta llegar al agua destilada. Es importante tener en cuenta que la mayoría de los colorantes se diluyen en agua, por lo que la hidratación debe terminar en agua. Sin embargo, si un colorante se diluye en alcohol, como la eosina alcohólica, la fucsina resorcina y la orceína, la hidratación en alcohol al 70% debe detenerse. Después de este proceso, la preparación está lista para ser teñida sumergiendo las preparaciones secuencialmente en los colorantes o reactivos elegidos.

Para la tinción de hematoxilina eosina, las secciones hidratadas deben sumergirse en la solución de hematoxilina de Maier durante 20 minutos, seguido de un enjuague de 25 minutos en agua corriente para completar el cambio de color del tinte. Posteriormente, las láminas se sumergen en alcohol al 70% durante 3 minutos para prepararlas para la tinción con eosina floxina alcohólica. Las secciones se tiñen durante un minuto con esta solución y se enjuagan rápidamente con alcohol al 95% para eliminar el exceso de tinte.

Después de la tinción, la deshidratación debe continuar con alcohol absoluto para garantizar una preparación efectiva del tejido. Un tejido insuficientemente deshidratado puede provocar artefactos durante el sellado. Luego se inicia la clarificación, donde el xileno elimina el alcohol de las preparaciones, haciéndolas aptas para montar en un medio permanente.

Después de la tinción y deshidratación, las diapositivas deben sellarse en un medio permanente para análisis futuro. El medio de sellado recomendado es goma damar, diluida en xileno. Una vez que el proceso esté completo, la diapositiva debe montarse usando una gota de goma damar y cubierta con un cubreobjetos. Se debe tener cuidado durante el sellado para evitar la formación de burbujas, lo cual podría dificultar la visualización de la sección histológica.

Los conceptos presentados en este DVD tienen como objetivo proporcionar apoyo teórico y práctico a los técnicos en histología. El material aborda los avances tecnológicos en histotecnología que han mejorado la velocidad, calidad y fiabilidad de los exámenes diagnósticos. Sin embargo, se señala la falta de personal calificado para manejar el soporte técnico que acompaña a estos avances, y el material busca contribuir a abordar esta brecha.

El material didáctico está dedicado al Dr. Enrique Leonel Lensi, una figura respetada en técnicas histológicas, que ha sido fundamental en la formación de profesionales en histotecnología en Brasil. El Dr. Lensi, un patólogo y científico dedicado, ha brindado orientación y apoyo a muchos a lo largo de los años, contribuyendo significativamente al campo.